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梯度洗脱可用于处理不能以等度洗脱分离的样品，而更常见的使用梯度的因素是多成分保留能力不同，无法在等度洗脱中全洗脱出来，或以等度方式无法达到满意的分离效果。总结下来，以下几种情况，可以采用梯度洗脱：

1、多组分样品的极性范围大，用等度无法全部洗脱的样品；

2、大分子样品；

3、改善峰峰型；

4、目标峰出峰后，短时间内提高有机相比例，洗脱强保留干扰杂质；

5、用等度洗脱无法达到分离的情况。

具有不同保留值范围的多组分，无法使用同一个等度完全洗脱下来。用同一个等度，会出现要么部分成分无保留没法分离，部分强保留无法洗脱下来，或一针洗脱时间过久的问题，这种情况下，选择梯度洗脱，使流动相洗脱能力从弱到强，从而达到不同保留值范围的多组分在同一个条件下实现分离。

大分子量样品（肽、蛋白质、合成聚合物等）一般采用梯度洗脱分离会更好，尤其是反相条件。这类样品，往往对有机相的量特别敏感，有机相的微小变化就会使样品的保留时间发生很大的变化，导致用等度条件检测时，无法使保留时间控制在一个稳定合适的范围内。

有些成分，在使用等度洗脱时，峰型不佳，不能满足检测需求，这种时候，可以采用梯度洗脱来改善峰型。因此，哪怕是单一成分的含量测定，有时也会用到梯度洗脱进行测定。

示例：4-哌啶甲酸的检测