2022-06-24
在日常分析中,我们会评估一支色谱柱、一个项目的柱效,在药典中,检查药物的含量时,规定了系统适应性试验中理论塔板数要求。那柱效、理论踏板数的关系是什么,怎么得到更佳柱效,今天小编和大家分享。
溶质分子在通过色谱柱时,扩散围成一个比较大的体积(或形成一个比较宽的谱带)。当色谱带离开色谱柱在色谱图上产生一个色谱峰时,它的宽度可以用不同的方式定义。如下图。
从峰的两边画正切线(通过拐点),它们和基线的交点就是峰宽W的值。柱效用于描述色谱柱提供窄峰的相对能力,用塔板数N定义:
比如,如上图中,色谱峰i的峰宽W等于(4.00-3.85)=0.15min,保留时间tR=3.93min。因此塔板数N=16(3.93/0.15)2=10980。塔板数N会因样品、分离条件和色谱柱的不同有很大区别。
峰宽可以更加方便(和精确)地用半峰宽W1/2来进行测定,如上图中的峰j,很多数据系统的半峰宽值W1/2≡0.588W。用半峰宽来计算塔板数的等式为:
N也可以用这个等式表达:
式中,H=L/N是指色谱柱的理论塔板高度,H是每单位柱长上柱效的量度,它代表分离过程中的峰展宽,越小越好。因此,增加柱长(比如用一根250mm的色谱柱来替代一根150mm的色谱柱)就能很快速的增加N和改善分离效果(因为H对于体积不同的色谱柱来说是一个常数)。
从上面两个等式,我们能看出,N值越大,色谱柱中的峰宽就越窄,分离效果就越好,柱效也就越高。那如何得到更窄的峰宽,更佳的柱效呢?
就要看范德姆特方程了,其等式如下:
式中,H表示理论塔板高度,v表示流动相的流速,A、B、C对于给定的溶质分子、色谱柱和一系列的实验条件来说都是常数。
A代表涡流扩散项。由于样品分子在各种填充颗粒之间以不同流速(箭头)通过色谱柱,在流速较低(受限或者变窄)的液流里移动的分子会拖在后面,在流速较高(较宽)的液流里移动的分子则会被带动跑到前方,这个影响谱带加宽的因素与流动相的流速无关,仅取决于色谱柱里填充颗粒的排列方式。
涡流扩散(不依赖于流速)
怎么减小它呢?
可以选用粒径更小、更均匀的颗粒填充色谱柱。
B/v代表纵向扩散项。溶质分子沿着色谱柱的纵向扩散,这个过程会导致带宽随着时间的增加而增大,无论流动相是否流动都会发生这种情况。
纵向扩散(时间依赖性)
怎么减小它呢?
可以提高流动相的流速v,选用较窄的柱子。
C*v代表传质阻力项,包括流动相和固定相的溶质转移。当流动相流速增加时谱带加宽会变严重。
流动相溶质转移(传质,依赖于流速)
固定相溶质转移(依赖于流速)
怎么减小它呢?
可以选用更小粒径的填充填料,还可以降低流动相的流速。
通常来说,柱外效应对带宽的影响可以忽略不计,但是也取决于设备特性和色谱柱的大小。以小颗粒填充的、体积较小的色谱柱特别会出现柱外谱带加宽的问题。
从前面的描述可以看出,di一项A和流速无关,第二项B/v和第三项C*v与流速的关系正好相反。这就需要找到一个更优速度,使总的H值更小。
在色谱柱确定,即A、B、C项确定的情况下,也可以通过计算来得到更佳流速值:
通过这个公式,可以计算出经典的4.6mm直径,5μm粒径的色谱柱,其更佳流速是1mL/min。
相信小伙伴们通过范德姆特方程能更加理解影响柱效的因素。