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敲黑板！！！His标签融合蛋白纯化常见问题和解决方案全收纳
2020-04-16
His标签融合蛋白的纯化是借助于层析介质上的过渡金属离子（如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等）与His融合蛋白上的His标签的配位作用实现目标蛋白的分离。组氨酸（His）的残基上带有1个咪唑基团，可以和Ni2+等过渡金属离子形成配位键而选择性的结合在金属离子上，这些金属离子通过螯合配体固定在层析介质上，因此带有His标签的蛋白可以特异性的吸附在螯合了Ni2+等过渡金属离子的层析介质上，而其他不含His标签的杂质蛋白则不能吸附或仅微弱吸附在介质上。通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱，可以将His标签融合蛋白从层析介质上解吸附下来，从而得到较高纯度的目标蛋白。
常用的His标签融合蛋白纯化的填料有Ni Tanrose 6FF（NTA/IDA）金属螯合亲和填料，但是在使用过程这种常常会出现一些问题，这里就给各位老师介绍下常见问题和解决方案
填料清洗
当填料使用过程中发现反压过高或者填料上面出现明显的污染时，需要进行在位清洗操作 （Cleaning-in-Place，CIP）。
建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。
去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类
通过使用 30%异丙醇清洗 5-10 个柱体积，接触时间为 15-20 分钟可以去除此类污染物。然后，再使用 10 倍柱体积的去离子水清洗。也可以选择使用含有去污剂的酸性或碱性溶液， 清洗填料 2 倍柱体积。例如，含有 0.1–0.5% 非离子去污剂的 0.1 M 醋酸溶液，接触时间 为 1–2 小时。去污剂处理后，需要使用 70%的乙醇清洗 5 个柱体积，以彻底去除去污剂。更后使用 10 倍柱体积的去离子水清洗。
去除离子作用结合的蛋白
使用 1.5M NaCl 溶液接触时间为 10-15 分钟清洗。然后，再使用去离子水清洗 10 个柱体 积。
填料再生
组氨酸标签蛋白亲和纯化填料所带的镍离子不需要经常螯合去除和重新挂镍离子。当填料使 用过程中发现颜色变浅，或者填料载量明显变低时，需要进行对填料进行镍离子剥离和重新 挂镍离子，也就是填料再生。将填料装填在合适的层析柱内，按照下面操作流程进行镍离子 剥离和重新挂镍离子。
1. 使用 0.2 M 醋酸溶液（含 6 M GuHCl）清洗 2 倍柱体积；
2. 使用去离子水清洗 5 倍柱体积；
3. 使用 2% SDS 清洗 3 倍柱体积；
4. 使用去离子水清洗 5 倍柱体积；
5. 使用乙醇清洗 5 倍柱体积；
6. 使用去离子水清洗 5 倍柱体积；
7. 使用 100 mM EDTA (pH 8.0)清洗 5 倍柱体积；
8. 使用去离子水清洗 5 倍柱体积；
9. 使用 100 mM NiSO4 清洗 5 倍柱体积；
10. 使用去离子水清洗 10 倍柱体积；填料再生后，可以立即使用，也可以保存在 20%的乙醇中，置于 4°C 保存。
常见问题及解决方案
01. 蛋白不挂柱
可能原因：His标签是否丢失
解决方案：大肠杆菌表达外源蛋白过程中，常出现序列丢失的现象，若是标签丢失，蛋白自然就无法挂柱了。可采用Western-Blot方法通过His抗体检测目标蛋白是否存在His标签。
可能原因：His标签是否暴露在融合蛋白表面
解决方案：在蛋白中加入适量的尿素或者盐酸胍等变性剂，若此时蛋白可以挂柱，说明蛋白表达过程中His标签可能暴露不充分，这个时候可以尝试在缓冲液中加入变性剂进行纯化。若因蛋白本身原因不能添加变性剂，则只能尝试上游条件的修改，要么增加His标签长度，提高标签暴露的几率，要么修改His标签的位置。
可能原因：更换过渡金属离子
解决方案：如果选择用的是Ni2+或Co2+，换成Cu2+或Zn2+则就有可能挂柱了。
可能原因：缓冲液选择是否正确
解决方案：如果缓冲液中需要添加巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）等还原剂，则需要选择具有NTA配基的螯合介质（常规条件下选择IDA配基的螯合介质即可）。
如果缓冲液中含有EDTA等具有强螯合作用的试剂，应在纯化前去掉。
此外，适当提高缓冲液pH值、降低缓冲液中的盐浓度或者更换成磷酸盐缓冲液都可能提高His标签蛋白的挂柱能力。
可能原因：提高接触时间
解决方案：适当降低流速，提高蛋白与螯合介质的接触时间，可以提高目标蛋白的挂柱能力。
02. His标签蛋白挂柱后洗脱不下来
可能原因：洗脱强度不够
解决方案：可适当增加洗脱液中咪唑的浓度或者降低pH值。
可能原因：蛋白和层析介质之间存在非特异性吸附
解决方案：可以尝试在洗脱液中添加去垢剂（如0.2%的TritionX-100）。
可能原因：蛋白是否沉淀在层析介质内部
解决方案：可以尝试降低上样量或通过咪唑梯度洗脱的方式来避免蛋白沉淀。
可能原因：改变缓冲液条件
解决方案：降低缓冲液pH、提高咪唑浓度、提高盐浓度或者换成Tris-HCl缓冲液都有可能解决目标蛋白洗脱不下来的问题。
可能原因：更换过渡金属离子
解决方案：如果用的是Ni2+，可以尝试换成Co2+，降低目标蛋白与过渡金属离子的螯合作用。
03. 洗脱后的His标签蛋白纯度不够
可能原因：优化过渡金属离子种类
解决方案：纯度不够的主要原因是宿主细胞蛋白中的一些含有组氨酸的杂蛋白吸附在鏊合介质上。因此，可以采用螯合能力弱的Co2+作为过渡金属离子，使得含有组氨酸的杂蛋白无法吸附在介质上，从而提高目标蛋白的纯度。
可能原因：优化上样和洗脱条件
解决方案：寻找更优的上样和洗脱条件，抑制杂蛋白的吸附（如增加上样缓冲液中咪唑的浓度），将杂蛋白和目标蛋白尽可能的分开。
可能原因：双标签纯化
解决方案：在进行上游构建时，给目标蛋白加双重标签，通过两步亲和层析，提高目标蛋白的纯度。
可能原因：多步纯化
解决方案：在金属螯合层析之后，根据蛋白分子量大小和带电荷情况，加一步凝胶过滤层析或者离子交换层析，尝试将目标蛋白与杂质进一步分离开来，提高目标蛋白纯度。
这些问题有没有解决您的疑惑呢？如果您还有蛋白纯化相关问题或对我们产品感兴趣的话，欢迎拨打2024欧洲杯买球app400-810-6969垂询，或者咨询2024欧洲杯买球app当地销售代表和经销商。
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